FastQC

FastQC je program nebo nástroj, který poskytuje kontrolu kvality sekvencí DNA na různých úrovních.

Poskytuje analýzy velkého množství sekvanačních dat získaných hlavně sekvenováním metodou “Next-Generation Sequencing”. Nástroje, které přináší QC report o kvalitě, většinou odhalí problémy, které vznikly sekvenátorem, ale report kvality, který přináší FastQC odhalí i problémy vzniklé již v počátcích přípravou laboratorních knihoven.^[1] Přináší rychlou kontrolu kvality sekvenčních dat od základní statistiky až po další analýzy. Po analyzování výsledky uživatel obdrží ve formátu HTML, kde v levém panelu podle barev okamžitě rozpozná úroveň výsledku analýzy potažmo kvality (výsledné moduly jsou označeny kruhy v barvách semaforu od zelené po červenou). Barevné rozdělení pro rychlou kontrolu – zelená fajfka – normální nebo dobrá kvalita, oranžový trojúhelník – mírně abnormální kontrolovaná kvalita a červený křížek – velmi neobvyklé. Více o konkrétních modulech/analýzách naleznete níže.

Lze s programem pracovat v interaktivním a neinteraktivním rozhraní. Interaktivní rozhraní je ve formě aplikace, to slouží pro rychlou analýzu několika souborů. Neinteraktivní, které uživatel ovládá přes příkazovou řádku terminálu, dokáže provést analýzu většímu počtu souborů. Alternativní možností pro analýzu opravdu velkého počtu souborů je nástroj MultiQC.^[2]

Nástroj FastQC dokáže analyzovat sekvence ve formátech souborů:^[3]

• FastQ (všechny kódovací varianty)
• Casava FastQ files – obvykle stejný formát jako FastQ, nicméně bývá několik souborů pro jeden jediný vzorek, přesto FastQC zahrne soubory pro jeden vzorek do jedné skupiny a vytvoří kompletní report pro všechny soubory od jednoho vzorku.
• Colorspace FastQ
• GZip komprimované FastQ
• SAM
• BAM

Níže stručný popis jednotlivých modulů.^[4]

Základní statistika popisuje ve shrnující tabulce základní údaje – typ souboru, název souboru, kódování – sekvenování (najít), kompletní počet sekvencí, zachycené sekvence s nízkou kvalitou, délka sekvencí, procentuální podíl GC.

Výsledný graf je rozdělen na tři bloky dle barev odrážejících kvalitu.

V ideálním případě by měl graf být čistě modrá obrazovka. V případě, že se objeví modrá obrazovka s několika barevnými plochami v barevné škále od teplých po studené barvy, značí, že uživatel má v datech sekvenovaných Illuminou ještě zůstalé identifikátory sekvencí z laboratorních knihoven.

Ukazuje zda některé skupiny sekvencí z celku mají přirozeně nízké hodnoty kvality.

Graf ukazuje proporci všech čtyř bází v souboru. U náhodných sekvencí lze očekávat rozložení rovnoměrné, a proto by v grafu měly všechny čtyři čáry (každá pro jednu ze čtyřech bází) jít rovnoměrně a vodorovně.

Neměl by být vychýlen, a ta ve výsledném grafu by měla jít čára vodorovně.

Měří obsah GC v celé délce každé sekvence v souboru a porovnává ho s grafem modelového obsahu GC.V grafu by měl výsledek pro soubor korespondovat s křivkou normálního rozložení dle modelu.

V případě, že by byl sekvenátor neschopný přečíst bázi, v souboru by se pro nepřečtené objevovaly nahrazené báze písmenem N. V grafu by měla být křivka kopírující osu x, tudiž nulový obsah báze N.

Tento modul generuje graf, který ukazuje distribuci délky fragmentů v sekvencích. Ve většině případů sekvenátor generuje fragmenty stejné délky, a tak v grafu je křivka s jedním vrcholem.

Tento modul ukazuje stupeň úrovně duplikace některých sekvencí v souboru.

Tento modul ukazuje sekvence, které se vyskytují nadměrně v souboru, od hladiny vyšší než 0,1 %. Buď to naznačuje, že jsou sekvence velmi signifikantní nebo naopak to značí kontaminaci vzorků. Výsledek není zobrazen grafem – buď je ve formě jedné informační věty, že soubor neobsahuje nadměrně se vyskytující sekvence, nebo ty nadměrně se vyskytující vypíše.

Kontroluje, zda nezůstaly v sekvencích nějaké sekvenační adaptory použité ke značení při sekvenaci.

• Oficiální stránky