Секретомика

Секретомика ― вид протеомика што вклучува анализа на секретомот односно на сите секретирани белковини на клетка, ткиво или организам.^[1] Секретираните белковини се вклучени во различни физиолошки постапки, вклучително и клеточно сигнализирање и ремоделирање на матрицата, но исто така се составен дел за инвазијата и метастазирањето на малигните клетки.^[2] Оттука, секретомиката е особено важна во откривањето на биомаркери за рак^[3] и разбирањето на молекуларната основа на патогенезата.^[4][5] Анализата на нерастворливата фракција на секретомот (екстрацелуларната матрица) е наречена матрисомика.^[6]

Во 2000 година, Тјалсма и колегите го измислиле поимот „секретом“ во нивната студија за еубактеријата B. subtilis. Тие го дефинирале секретомот како сите секретирани белковини и секреторната машинерија на бактериите. Користејќи база на податоци на белковински секвенци во B. subtilis и алгоритам кој ги разгледува местата на расцепување и амино-терминалните сигнални пептиди карактеристични за секретираните белкови, тие биле во можност да предвидат кој дел од протеомот се лачи од клетката.^[7] Во 2001 година, истата лабораторија поставила стандард за секретомика - предвидувањата засновани само на секвенцата на аминокиселините не се доволни за да биде дефиниран секретомот. Тие користеле дводимензионална гелска електрофореза и масена спектрометрија за да идентификуваат 82 белковини секретирани од B. subtilis, од кои само 48 биле предвидени со користење на методот заснован на геном од нивниот претходен труд.^[8] Ова ја покажува потребата за белковинска верификација на предвидените наоди.

Како што била откриена сложената природа на секреторните патишта - имено дека постојат многу некласични патишта на секреција и има многу несекретирани белковини кои се дел од класичниот секреторен пат - станало неопходна подлабока дефиниција на секретомот. Во 2010 година, Агравал и колегите предложиле дефинирање на секретомот како „глобална група на секретирани белковини во екстрацелуларниот простор од клетка, ткиво, орган или организам во кое било дадено време и услови преку познати и непознати секреторни механизми кои вклучуваат конститутивни и регулирани секреторни органели“.^[9]

Во културата, клетките се опкружени со загадувачи. Говедскиот серум од медиумот за клеточна култура и клеточниот отпад може да ја контаминира збирката на секретирани белковини што се користени за анализа. Контаминентите на говедата претставуваат посебен предизвик бидејќи белковинските секвенци на многу екстрацелуларни белковини од говеда, како што се фибронектинот и фибулин-1, се слични на секвенците на човечките белковински секвенци.^[1] За да бидат отстранети овие загадувачи, клетките може да бидат измиени со фосфатно пуфирана сол или медиум без серум пред да бидат инкубирани во медиумот без серум и да бидат собрани секретираните белковини. Мора да се внимава да не пукнат клетките, ослободувајќи интрацелуларни белковини.^[1] Покрај тоа, времето и условите на инкубација мора да се оптимизираат така што метаболичкиот стрес што може да биде предизвикан од недостатокот на хранливи материи во медиумот без серум да не влијае на секретомската анализа.^[10]

Некои белковини се излачуваат во мало изобилство, а потоа дополнително се разредуваат во медиумот за клеточна култура или течност во телото, што ги прави овие белковини тешки за откривање и анализа. Може да бидат користени методи на концентрација како таложење на трикарбоксилната киселина,^[10] како и високо чувствителни методи како антителни микрочипови кои можат да забележуваат дури и поединечни молекули на белковина.^[11]

Многу секретомски студии се спроведувани ин витро со методи на клеточна култура, но не е јасно дали истите белковини се лачат во живо (in vivo). Сè повеќе студии, особено оние кои го разгледуваат секретомот на ракот, користат методи во живо за да ја потврдат релевантноста на резултатите добиени ин витро. На пример, проксималните биолошки течности може да бидат собирани во непосредна близина на туморот со цел да биде спроведена секретомска анализа.^[1]

Многу секретирани белковини имаат N-терминална пептидна секвенца која сигнализира преведената белковина да биде преселена во ендоплазматскиот ретикулум каде што се случува обработката што на крајот ќе доведе до секреција. Присуството на овие сигнални пептиди може да биде користено за да биде предвиден секретомот на клетката.^[1] Некои секреторни белковини немаат класични сигнални пептидни секвенци. Тие се нарекувани „секреторни белковини без водачи“.

Методите на предвидување на целиот геном имаат различни проблеми. Постои голема можност за лажни позитиви и лажни негативни. Дополнително, генското изразување е под силно влијание на условите на животната средина, што значи дека секретомот предвиден од геномот или библиотеката на комплементарната ДНК веројатно нема целосно да биде совпаднат со вистинскиот секретом.^[9] Протеомски пристапи се неопходни за да бидат потврдени сите предвидени секретирани белковини.

Достапни се неколку бази на податоци за секретом или бази на знаење ширум геномот врз основа на курирање и сметачко предвидување. Овие бази на податоци вклучуваат база на податоци за габични секретоми, база на знаење за габични секретоми,^[12] и база на податоци за бактериски секретом на млечна киселина.^[13] Базата на податоци за подклеточно место на човечки и животински белковини (MetaSecKB Архивирано на 6 април 2016 г.) и базата на податоци за подклеточен протеом на протистите (ProtSecKB) биле исто така неодамна објавени. Иако има некои неточности во сметачкото предвидување, овие бази на податоци обезбедуваат корисни ресурси за понатамошно карактеризирање на белковинските подклеточни места.

Анализата на масената спектрометрија е составен дел на секретомиката. Серумот или супернатантот што содржи секретирани белковини се варени со протеаза и белковините се одвојувани со дводимензионална гелска електрофореза или хроматографски методи. Секој поединечна белковина потоа е анализирана со масена спектрометрија и создадениот отпечаток од масата на пептид може да биде изврши низ базата на податоци за да биде идентификувана белковината.^[1]

Стабилното означување на изотоп со аминокиселини во клеточна култура се појавило како важен метод во секретомиката - помага да се направи разлика помеѓу секретираните белковини и загадувачите на говедскиот серум во клеточната култура. Супернатантот од клетките одгледувани во нормална средина и клетките одгледувани во средина со аминокиселини означени со стабилен изотоп се меша во сооднос 1:1 и е анализиран со масена спектрометрија. Белковинските загадувачи во серумот ќе покажат само еден врв бидејќи немаат означен еквивалент.^[1] Како пример, методот со стабилно означување на изотоп со аминокиселини во клеточна култура е успешно користен за да биде направена разлика помеѓу белковините кои се секретирани од човечки хондроцити во културата и серумските контаминанти.^[14]

Антителниот микрочип е високо чувствителен и високопропусна метода за забележување на белковини која неодамна станала дел од секретомската анализа. Антителата, или друг вид на молекула на врзивно средство, се фиксираат на цврста потпора и се додава флуоресцентно означена белковинска смеса. Интензитетот на сигналот е користен за да бидат идентификувани белковините. Антителниот микрочип се исклучително разновидни - тие можат да бидат користени за анализа на количината на белковини во мешавината, различни белковински изоформи, послепреведувачки модификации и биохемиска активност на белковините. Покрај тоа, овие микросреди се многу чувствителни - тие можат да забележуваат единечни молекули на белковина. Микронизите на антитела моментално се користени најмногу за анализа на примероци од човечка плазма, но може да бидат користени и за култивирани клетки и секретомика на телесните течности, што претставува едноставен начин да се бара присуство на многу белковини во исто време.^[11]

Покрај тоа што се важни во нормалните физиолошки постапки, секретираните белковини имаат и интегрална улога во туморигенезата преку клеточен раст, селење, инвазија и ангиогенеза, што ја прави секретомиката одличен метод за откривање на биомаркери на ракот.^[15] Користењето на телесни течности или полн серумски протеомски метод за да бидат идентификувани биомаркерите може да биде исклучително тешко - телесните течности се сложени и многу променливи. Секретомската анализа на клеточните линии на ракот или заболеното ткиво претставува поедноставна и поконкретна алтернатива за откривање на биомаркери.^[10]

Двата главни биолошки извори за секретомика на ракот се супернатантите на клеточната линија на ракот и проксималните биолошки течности, течностите во допир со туморот. Супернатантот на клеточната линија на ракот е атрактивен извор на секретирани белковини. Постојат многу стандардизирани клеточни линии достапни и супернатантот е многу поедноставен за анализа од приближната телесна течност. Но, не е јасно дали секретомот на клеточната линија е добра претстава за вистински тумор во неговата специфична микросредина и стандардизираната клеточна линија не е илустрација за хетерогеноста на вистинскиот тумор.^[15] Анализата на проксималните течности може да даде подобра идеја за секретомот на човечки тумор, но овој метод има и свои недостатоци. Сè уште треба да бидат стандардизирани процедурите за собирање проксимални течности и потребни се немалигни контроли. Покрај тоа, еколошките и генетските разлики меѓу пациентите може да ја усложат анализата.^[15]

Секретомската анализа открила потенцијални нови биомаркери во многу видови на рак, вклучувајќи рак на белите дробови, рак на црниот дроб, рак на панкреасот, рак на дебелото црево, рак на простата и рак на дојката. Специфичен антиген на простата, сегашниот стандарден биомаркер за рак на простата, има ниска дијагностичка специфичност - нивоата на специфичниот антиген на простата не можат секогаш да разликуваат меѓу агресивен и неагресивен карцином - и затоа е многу потребен подобар биомаркер. Користејќи секретомска анализа на клеточните линии на простата, една студија успеала да открие повеќе белковини кои се наоѓаат во повисоки нивоа во серумот на пациентите со рак отколку кај здравите контроли.^[10]

Исто така, постои голема потреба од биомаркери за откривање на рак на дојка - во моментов биомаркерите постојат само за следење на подоцнежните фази на ракот.^[2] Секретомската анализа на клеточните линии на рак на дојка довело до откривање на белковината ALCAM како нов биомаркер со ветувачки дијагностички потенцијал.^[10]

Анализата на човечкиот ембрионски секретом може да биде корисна за пронаоѓање на неинвазивен метод за одредување на одржливоста на ембрионите. Во оплодувањето со ин витро, ембрионите се проценувани на морфолошки критериуми во обид да се пронајдат оние со висок потенцијал за имплантација. Пронаоѓањето на поквантитативен метод на проценка може да помогне да биде намален бројот на ембриони кои се користени при оплодувањето со ин витро, а со тоа да бидат намалени бременостите од повисок ред. На пример, една студија успеала да развие секретомни отпечатоци од прсти за многу бластоцисти и откри 9 белковини кои можат да разликуваат бластоцисти со нормален и абнормален број на хромозоми. Оваа врста на анализа може да помогне да биде заменета предимплантациониот генетски преглед, кој вклучува биопсија на ембрионски клетки и може да биде штетен за развојот.^[16]