История молекулярной биологии

История молекулярной биологии начинается в 1930-х годах с объединения ранее отдельных биологических дисциплин: биохимии, генетики, микробиологии и вирусологии. Кроме того, в надежде, что новая дисциплина откроет возможности понимания фундаментальных основ жизни, в неё пришли многие химики и физики.

Молекулярная биология в современном понимании объясняет феномен жизни, начиная от свойств макромолекул. В особенности в центре внимания молекулярных биологов оказались два их вида: 1) нуклеиновые кислоты, среди которых наиболее известна ДНК, на ней зафиксирована структура генов, и 2) белки, активность которых обеспечивает жизнь на молекулярном уровне. Согласно одному из определений молекулярной биологии, эта дисциплина характеризует структуру, функции и отношения между этими двумя типами макромолекул.

Название новой дисциплины было предложено Уорреном Уивером, директором отдела естественных наук Фонда Рокфеллера, в 1938 г. Поначалу подразумевалось, что от неё ожидается объяснение физических и химических основ жизни. После того, как в 1910-х годах законы Менделя получили широкое признание в научных кругах, а в 1920-х годах развитие атомной теории привело к разработке принципов квантовой механики, казалось, что наука вплотную подошла к открытию молекулярного фундамента феномена жизни. Уивер от имени Фонда Рокфеллера поддерживал и финансировал исследования на стыке биологии, химии и физики, и даже такие знаменитости, как Нильс Бор и Эрвин Шрёдингер, пытались подвести под биологию теоретическую базу так, как они это делали в теоретической физике. Однако в 1930-х — 1940-х годах не было ясно, какие именно исследования приведут к цели, если эта цель вообще достижима. В том числе проводились исследования в коллоидной химии, биофизике, радиобиологии и кристаллографии.

В 1940 г. Джордж Бидл и Эдуард Тейтем показали факт существования связи между генами и белками^[1], связав генетику с биохимией. Они предложили генетикам вместо дрозофилы использовать в качестве модельного организма грибок нейроспору. Использование более широкого спектра модельных организмов было чрезвычайно важно для появления новой дисциплины. В 1944 г. Освальд Эвери, работавший в Рокфеллеровском университете с бактериями, показал, что гены состоят из ДНК^[2] (см. Эксперимент Эвери, Маклеода и Маккарти). В 1952 г. Алфред Херши и Марта Чейз подтвердили, что генетический материал бактериофага тоже состоит из ДНК^[3] (см. Эксперимент Херши — Чейз). В 1953 г. Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик предложили двухспиральную структуру молекулы ДНК^[4]. Их структурная модель действительно позволила объяснить многие фундаментальные биологические феномены, такие как существование очень больших биологических молекул, способ хранения и точного копирования информации о их структуре, возможность изменения структуры генов в эволюции и др., в результате чего молекулярная биология обрела свои основные принципы.

В 1961 г. Франсуа Жакоб и Жак Моно предположили, что между ДНК и белком должен быть посредник, который они назвали информационной РНК. В 1961—1965 гг. с расшифровкой генетического кода стало понятно, как информация, хранящаяся на ДНК, определяет структуру белка, и какие именно сочетания нуклеотидов в структуре ДНК соответствуют определенным аминокислотам белка. В начале 1960-х годов Жакоб и Моно показали также, как белок может регулировать транскрипцию и экспрессию генов^[5].

Главные открытия в молекулярной биологии были сделаны на протяжении примерно четверти века. Затем понадобилось ещё пятнадцать лет исследований, прежде чем на их основе были разработаны новые сложные технологии, которые сейчас в совокупности называют генетической инженерией. Они позволили выделять и характеризовать отдельные гены, в том числе из весьма сложно устроенных живых организмов, включая человека.

Оценивая молекулярную революцию в контексте истории биологии, нетрудно заметить, что рождение молекулярной биологии было кульминацией длительного процесса, который начался с первых наблюдений, сделанных под микроскопом. Ранние исследователи пытались понять, как функционируют живые организмы на микроскопическом уровне. С конца XVIII в. все большее внимание уделялось описанию особенностей химических молекул, производящихся живыми организмами. Так в трудах выдающихся химиков, таких как Юстус Либих, родилась физиологическая химия, предшественница современной биохимии, в свою очередь, обязанной своим рождением Эдуарду Бухнеру. Однако между молекулами, которые изучали химики, и тонкими структурами, заметными под микроскопом, например, хромосомами, лежала область неизвестного, «мир упущенных измерений», как его называл выдающийся физико-химик Вольфганг Освальд. Этот мир населяли коллоиды, химические соединения, структура и свойства которых оставались неясными.

Успех молекулярных биологов в исследовании этого неизвестного мира обеспечило появление новых методов физики и химии, таких как рентгеноструктурный анализ, электронная микроскопия, ультрацентрифугирование, электрофорез.

Поворотным пунктом в этом процессе стала работа Лайнуса Полинга 1949 г., в которой впервые болезнь человека, серповидноклеточная анемия, была связана с мутацией в молекуле гемоглобина.

При рождении молекулярной биологии произошла встреча двух дисциплин, переживавших в первой половине XX века период бурного развития: биохимии и генетики. Биохимики изучали структуру и функции молекул, из которых состоит живая материя. Между 1900 и 1940 гг. были описаны центральные процессы метаболизма: пищеварение и усваивание питательных веществ, в частности, углеводов. Каждый из элементарных химических процессов, из которых состоит метаболизм, катализируется особым ферментом. Ферменты — это белки, так же как антитела крови и белки, отвечающие за сокращения мускулатуры. Поэтому изучение структуры и функции белков стало одной из важнейших задач биохимии. Генетики, благодаря введению Томасом Морганом плодовой мушки дрозофилы в качестве модельного организма, установили справедливость законов Менделя и открыли множество новых фактов и закономерностей в отношениях между генами. В частности, Морган показал, что гены локализованы на хромосомах. Тем не менее, химическая природа генов и молекулярные механизмы их действия оставались загадкой.

В 1869 г. Иоганн Фридрих Мишер открыл вещество, которое он назвал нуклеином. Позже он очистил образец из спермы лосося, и в 1889 г. его ученик, Рихард Альтман, назвал его нуклеиновой кислотой. В 1919 г. в Рокфеллеровском институте был проведен химический анализ нуклеиновой кислоты, в составе которой были идентифицированы четыре азотистых основания, сахар и фосфат, соединенные между собой ковалентными связями в порядке фосфат-сахар-основание. Каждая из этих единиц получила название нуклеотид. Однако поначалу предполагалось, что четыре нуклеотида соединены между собой в короткие цепи одинаковой структуры. Лишь в 1934 г. Торбьёрн Касперссон и Эйнар Хаммерстен показали, что ДНК — это полимер.

В 1927 г. Н. К. Кольцов предположил, что наследуемые признаки должны передаваться из поколения в поколение вместе с гигантскими молекулами, которые состоят из двух зеркальных цепей, реплицируемых полуконсервативным способом, и каждая из цепей при репликации служит матрицей для синтеза новой^[6]. В 1935 г. Макс Дельбрюк, Н. В. Тимофеев-Ресовский и Карл Циммер предположили, что хромосомы — это гигантские молекулы, структура которых может быть изменена путём облучения рентгеновскими лучами, что приводит к изменению наследуемых признаков. В 1937 г. Уильям Астбери получил первые результаты рентгеноструктурного анализа ДНК, но не сумел сделать выводы о её структуре. Было только ясно, что эта структура является регулярной.

Критический эксперимент, доказывающий, что гены состоят из ДНК, был поставлен в 1943 г. Освальдом Эвери и его соавторами, которые продолжали работу трагически погибшего в начале Второй мировой войны Фредерика Гриффита со штаммами пневмококков. В экспериментах Гриффита происходила трансформация невирулентных бактерий шероховатого типа (R) в вирулентный гладкий штамм (S). Эвери выделил «трансформирующий принцип» и идентифицировал его как ДНК. Аналогичный эксперимент был поставлен в 1953 г. Алфредом Херши и Мартой Чейз, которые работали с бактериофагом Т2. В своей работе они тоже показали, что генетическим материалом фага является ДНК.

В 1950-х годах три группы ученых добились успеха в исследованиях структуры биологических макромолекул. Первая работала в Кингс-колледже (Лондон), в неё входили Морис Уилкинс и Розалинда Франклин. Вторая состояла из Фрэнсиса Крика и Джеймса Уотсона из Кембриджа. Третья группа, возглавляемая Лайнусом Полингом, работала в Калифорнийском технологическом институте (США). Уотсон и Крик конструировали модели структуры из шариков, соединенных металлическими стержнями, исходя из данных о структуре отдельных нуклеотидов и расстояниях между атомами. Франклин и Уилкинс анализировали данные кристаллографии и рентгеноструктурного анализа.

Группа Полинга в 1948 г. на основании таких же исследований обнаружила, что в пространственной структуре многих белков имеются более или менее крупные части в виде спирали. Аналогичные выводы можно было сделать и на основании данных Франклин и Уилкинса на ДНК. Окончательные выводы о спиралевидной структуре ДНК, наличии в ней двух цепей, связанных между собой водородными связями между отдельными нуклеотидами, обращенными друг к другу, и их комплементарности были сделаны Уотсоном и Криком. Им помог Эрвин Чаргафф, посетивший в 1952 г. Кембридж и напомнивший о своих экспериментах 1947 г., когда он обнаружил, что в разных образцах ДНК соотношение нуклеотидов варьирует, но аденин всегда присутствует в той же пропорции, в какой и тимин, а гуанин — в такой же, как и цитозин.

Первую точную модель ДНК Уотсон и Крик построили в 1953 г. на основании данных, полученных к этому моменту Франклин^[7]. Их открытие вызвало необыкновенный энтузиазм как у ученых, так и у широкой публики. Статья Уотсона и Крика была опубликована в Nature 25 апреля. Её содержание было дублировано публичным докладом заведующего лабораторией, в которой работали Уотсон и Крик, Уильяма Брэгга, 14 мая. Уже 15 мая о нём была помещена заметка в лондонской газете News Chronicle, а 16 мая — в The New York Times. В 1962 г. Уотсон, Крик и Уилкинс получили за это открытие Нобелевскую премию. Розалинд Франклин к этому времени уже скончалась от рака в 1958 г.

В 1957 г. Крик предложил формулу, которая получила известность как «центральная догма молекулярной биологии». Согласно этой формуле, ДНК является хранилищем информации о структуре белка. Посредником между ними является РНК. Предполагавшийся механизм полуконсервативной репликации ДНК был к этому времени подтвержден экспериментом Мезельсона и Сталя. Крик и его соавторы показали, что генетический код состоит из нуклеотидных триплетов, названных кодонами, каждый из которых кодирует один аминокислотный остаток белка. К 1966 г. Хар Корана и др. расшифровали генетический код, установив соотношения между кодонами ДНК и аминокислотными остатками белка.

Ранние работы по исследованию структуры РНК также относятся к 1950 м годам. Уотсон и Крик предполагали, что наличие у рибозы 2`OH группы препятствует образованию двойной спирали, характерной только для ДНК^[8]. Были сомнения даже в способности этой макромолекулы к образованию любой спиральной структуры. Высокая степень гетерогенности очищенных образцов препятствовала получению на РНК отчетливых снимков дифракционной картины и их рентгеноструктурному анализу. В 1955 г. был открыт фермент полинуклеотидфосфорилаза^[9], с помощью которого стал возможен искусственный синтез гомогенных нуклеиновых кислот, и данные рентгеноструктурного анализа значительно улучшились. Оказалось, что РНК не только может образовать спираль, но, как и ДНК, способна к созданию двойной спирали, хотя её структура и отличалась от двойной спирали ДНК.

В конце 1950 — начале 1960-х годов было опубликовано множество результатов исследований РНК, в том числе о гибридизации РНК и ДНК с образованием двойных спиралей из цепей обеих макромолекул^[10] и даже тройной спирали РНК^[11], а также о структуре небольших фрагментов РНК и динуклеотидов G-C и A-U, кристаллизованных в виде завитков спирали^[12]. Современный обзор этих работ был опубликован в 2009 г.^[13]

К середине 1960-х годов были открыты рибосомы, показана их роль в синтезе белка и необходимость информационной РНК для их сборки. Кроме информационной РНК и РНК, входящей в структуру рибосом, в синтезе белка участвовали также транспортные РНК, доставляющие аминокислоты к рибосоме^[14]. В 1965 г. была определена первичная структура первой транспортной РНК^[15], а к 1968 г. сразу несколько групп ученых получили кристаллы транспортных РНК, хотя ещё недостаточно хорошего качества, чтобы стало возможно определить их пространственную структуру^[16]. Эта цель стала достижимой благодаря кристаллизации в 1971 г. тРНК^PHE из дрожжей^[17]. Работа по исследованию пространственной структуры тРНК^PHE была закончена к 1973 г.^[18] Впоследствии методы этой пионерской работы были применены к кристаллизации и исследованию пространственной структуры и других тРНК^[19][20]. Оказалось, что кроме линейной или спиралевидной формы, по крайней мере, такие РНК, как транспортные, как и белки могут иметь компактную глобулярную структуру.

В 1980-х годах было показано, что некоторые РНК способны к аутокаталитическому расщеплению^[21][22][23]. РНК, способные, как и ферменты, катализировать химические реакции, такие как аутокаталитическое расщепление, назвали рибозимами. В 1990-х годах у некоторых из рибозимов была изучена пространственная структура^[24][25]. Это были первые глобулярные РНК кроме транспортных, у которых стало возможно изучать пространственную структуру. На этой основе далее были проведены исследования особенностей формирования структуры РНК, выявление консервативных структурных мотивов, локальных стабилизирующих взаимодействий между фрагментами нуклеотидной последовательности и т. д.^[26]. Эти достижения стали возможными, благодаря появлению метода транскрипции in vitro. Кроме того, для изучения структуры РНК начали применять ядерный магнитный резонанс, который оказался особенно полезен для исследования малых РНК (RNAs)^[27][28][29].

Впоследствии развитие методов изучения структуры РНК позволило исследовать пространственную структуру ещё целого ряда макромолекул этого вида, включая рибосомальную РНК^[30][31]. За работу по исследованию пространственной структуры рибосомальной РНК Ада Йонат, Венкатраман Рамакришнан и Томас Стейц получили Нобелевскую премию.

Как особый класс биологических молекул, белки были определены ещё в XVIII в. Антуаном де Фуркруа. Вначале их называли альбуминами (matières albuminoides, albuminoids или Eiweisskörper) и их характерными свойствами считали способность к свертыванию или коагуляции при обработке теплом или кислотой. Широко известными примерами таких белков к началу XIX в. считали яичный альбумин, альбумин из сыворотки крови, фибрин и клейковину пшеницы. Сходство между свертыванием яичного белка и створаживанием молока было известно с древнейших времен. Даже само слово альбумин было предложено ещё Плинием Старшим и происходит от латинского выражения albus ovi (белок яичный).

Якоб Берцелиус и Геррит Ян Мульдер провели элементный анализ растительных и животных белков и пытались определить их эмпирическую формулу. К их удивлению, у всех белков формула оказалась приблизительно одинаковой: C₄₀₀H₆₂₀N₁₀₀O₁₂₀, различными были лишь содержание серы и фосфора, присутствовавшие в относительно небольших пропорциях. Мульдер предполагал, что существует единая базовая белковая субстанция (Grundstoff), которая синтезируется в растениях и усваивается животными при переваривании. Берцелиус поддержал эту идею, назвав субстанцию протеином.

Я предложил наименование протеин для органического оксида фибрина и альбумина, я хотел бы произвести это слово от греческого πρωτειος, потому что он представляется примитивной или принципиальной субстанцией пищеварения у животных.

Оригинальный текст (англ.)

The name protein that I propose for the organic oxide of fibrin and albumin, I wanted to derive from the Greek word πρωτειος, because it appears to be the primitive or principal substance of animal nutrition.

Оригинальный текст (фр.)

Le nom protéine que je vous propose pour l’oxyde organique de la fibrine et de l’albumine, je voulais le dériver de πρωτειος, parce qu’il paraît être la substance primitive ou principale de la nutrition animale.

— Из личной переписки Берцелиуса от 10 июля 1838 г.

Мульдер также идентифицировал продукты деградации протеина, в частности, аминокислоту лейцин, и определил её молекулярную массу, 131 Da.

Минимальная молекулярная масса протеина, согласно анализу Мульдера, была примерно 9 kDa, в сотни раз больше, чем у большинства других молекул, с которыми ему доводилось сталкиваться. Поэтому химическая структура протеина (точнее, первичная структура) оставалась неизвестной до 1949 г., когда Фредерик Сенгер определил аминокислотную последовательность первого белка, которым был инсулин. Однако теоретически ещё в 1902 г. Франц Хофмайстер и Эмиль Фишер предсказали, что белки представляют собой линейную цепь из аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями. Многие ученые сомневались, что столь длинные аминокислотные цепи могут оставаться стабильными в растворе, и существовали также альтернативные теории о возможном строении белков. Например, согласно коллоидной гипотезе, белки состоят из циклолов.

То, что белки все-таки являются макромолекулами с определенной структурой, а не коллоидными смесями, показал Теодор Сведберг с помощью аналитического ультрацентрифугирования. При помощи очистки из ткани трудно получить белок в количестве более, чем несколько миллиграммов. Поэтому ранние исследования проводили на протеинах, легко очищаемых из яичного белка, крови, а также различных токсинов и пищеварительных соков, получаемых со скотобоен. Техника очистки белка быстро развивалась во время Второй мировой войны в связи с необходимостью получать очищенные белки крови для лечения раненых солдат. В конце 1950 г. американская компания Armour and Company очищала в больших количествах рибонуклеазу А и бесплатно предоставляла её для исследований. В результате РНКаза А на несколько десятилетий стала основным объектом фундаментальных исследований для множества научных групп. В частности, на ней было сделано несколько работ, удостоенных Нобелевской премии.

Исследования пространственной структуры белка начались в 1910-х годах, когда Крик и Мартин показали, что при коагуляции выпадению белка в осадок предшествует другой процесс, денатурация, при которой белок теряет растворимость и ферментативную активность, но приобретает дополнительные химические свойства. В середине 1920-х годов было отмечено, что иногда денатурация может быть обратимой и изменение свободной энергии при этом процессе существенно меньше, чем при обычных химических реакциях, а к 1929 г. появились представления о том, что денатурация представляет собой изменение конформации аминокислотной цепи, при которой остатки, ранее находившиеся внутри белковой глобулы, теперь экспонированы в растворитель. В таком случае растворимость должна понижаться в соответствии со сравнительно низкой растворимостью аминокислот с алифатическими и ароматическими боковыми группами. Соответственно появляются дополнительные химические свойства и утрачивается ферментативная активность.

В начале 1960 г. Кристиан Анфинсен показал, что РНКаза А действительно денатурирует обратимо, и что естественная конформация этого белка соответствует глобальному минимуму свободной энергии.

Когда структура белка ещё не была известна, Дороти Ринч и Ирвинг Ленгмюр для обоснования гипотезы о циклолах предположили, что эти структуры стабилизируются за счет гидрофобных связей. Хотя идею о гидрофобных взаимодействиях поддержал сам Джон Бернал, она в 1930-х годах была отвергнута вместе с гипотезой о циклолах Лайнусом Полингом и другими исследователями. Полинг был сторонником водородных связей, теорию которых развивал Уильям Астбери. Несмотря на то, что роль водородных связей в стабилизации структуры белка в конце концов оказалась незначительной, это не помешало Полингу верно сформулировать представления об основных структурных элементах белка, альфа-спиралях и бета-складках. Значимость гидрофобных связей прояснилась лишь к 1959 г., когда было показано, что ионизация части аминокислотных остатков, показанная ещё Арне Тиселиусом, играет роль лишь на поверхности белковой глобулы, где полипептидная цепь входит в контакт с растворителем.

Пространственную структуру глобулярных белков вначале изучали лишь гидродинамическими методами и ультрацентрифугированием. В 1950-х годах появились спектральные методы, включая круговой дихроизм, флуоресценцию, определение спектров поглощения в ультрафиолетовой и инфракрасной областях. Кристаллография и рентгеноструктурный анализ для определения пространственной структуры гемоглобина были впервые применены Перуцом и Кендрю в 1960-х годах. За эту работу они были удостоены Нобелевской премии. В 1980-х годах начали также применять ядерный магнитный резонанс. К 2006 г. Protein Data Bank содержал данные о пространственной структуре 40 тысяч белков. Благодаря выявлению консервативных доменов, гомологичные структуры разных белков теперь можно реконструировать при помощи компьютерных программ, а для исследования структуры больших межбелковых комплексов применяют криоэлектронную микроскопию.

• История биологии
• История генетики

• Fruton, Joseph. Proteins, Genes, Enzymes: The Interplay of Chemistry and Biology. New Haven: Yale University Press. 1999. ISBN 0-300-07608-8
• Lily E. Kay, The Molecular Vision of Life: Caltech, the Rockefeller Foundation, and the Rise of the New Biology, Oxford University Press, Reprint 1996
• Morange, Michel. A History of Molecular Biology. Cambridge, MA: Harvard University Press. 1998.