Капиллярный электрофорез-масс спектрометрия

Капиллярный электрофорез-масс-спектрометрия (КЭ-МС) — метод аналитической химии, основанный на комбинации капиллярного электрофореза с масс-спектрометрией.^[1] КЭ-МС сочетает в себе преимущества КЭ и МС, обеспечивая высокую эффективность разделения и предоставляя полную информацию о молекулярной массе веществ в единичном анализе.^[2] Метод обладает высокой разрешающей способностью, чувствительностью, скоростью анализа, при этом требуется минимальный объем образца (несколько нанолитров). Ионы обычно получают путем ионизации электрораспылением,^[3] но они также могут быть образованы методом матричной лазерной десорбции / ионизации^[4] или с помощью других способов ионизации. Метод нашел применение для фундаментальных исследований в области протеомики^[5] и количественного анализа биомолекул^[6] а также в клинической медицине.^[7][8] С момента его появления в 1987 году метод претерпевал различные модификации и усовершенствования. Сейчас КЭ-МС является одной из наиболее эффективных техник разделения и определения. КЭ-МС активно используется для анализа белков, пептидов, метаболитов и других биомолекул. Однако, разработка онлайн КЭ-МС вызывает множество трудностей и требует детального подхода. В решении проблем при сочетании капиллярного электрофореза с масс-спектрометрией особенно важно понимание принципов капиллярного электрофореза, настройки интерфейса, техники ионизации и системы масс-спектрометрического детектирования.

Самый первый интерфейс (способ соединения) между капиллярным зонным электрофорезом и масс-спектрометрией был разработан в 1987 году^[9] Ричардом Д. Смитом и его сотрудниками из Тихоокеанской Северо-Западной национальной лаборатории. Позже они также участвовали в разработке интерфейсов с другими вариантами КЭ, такими как капиллярный изотахофорез и капиллярное изоэлектрическое фокусирование.

Существует два распространённых метода ввода образца в систему КЭ-МС, аналогичные способам, применяемых для традиционного КЭ: гидродинамический и электрокинетический ввод.

Для введения пробы капилляр сначала помещается в виалу с образцом. Существуют разные способы гидродинамического ввода: путём приложения давления на входе в капилляр, созданием вакуума на конце капилляра или поднятием виалы с образцом относительно конца капилляра.^[10] При гидродинамическом способе можно обеспечить определённый объем вводимой пробы, а значение RSD для объёма образца последовательных вводов обычно ниже 2 %. Вводимый объем и воспроизводимость анализа как правило зависят от продолжительности ввода, смещения виалы с образцом по высоте относительно конца капилляра и/или давления, приложенного к пробе. Например, было выяснено, что использование более высокого давления и меньшего времени ввода способствует уменьшению RSD для площадей пиков и времени миграции аналитов.^[11] Одним из основных преимуществ гидродинамического ввода является то, что в данном методе эффективность ввода молекул в капилляр не зависит от их электрофоретической подвижности. Для увеличения производительности и скорости анализа КЭ-МС была создана методика гидродинамического мультисегментного ввода. В этом случае несколько образцов вводятся гидродинамически в капилляр перед анализом, при этом каждый сегмент образца находится между разделителями, заполненными фоновым электролитом.^[12]

В этом методе к раствору с образцом прикладывают высокое напряжение. Молекулы вводятся в разделительный капилляр путём электромиграции под воздействием электроосмотического потока раствора.^[10] При электрокинетическом вводе улучшается чувствительность по сравнению с гидродинамическим способом, особенно при использовании более низкого напряжения и более длительного времени ввода. Однако, воспроизводимость площадей пиков и времени миграции аналитов хуже. Эффективность ввода связана с электрофоретической подвижностью образцов: молекулы с высокой подвижностью вводятся активнее. В результате, электрокинетический метод ввода чувствителен к матричным эффектам и изменениям ионной силы раствора образца.

Капиллярный электрофорез — это метод разделения, в котором высокое напряжение применяется для создания электроосмотического потока при разделении ионов. Аналиты мигрируют от одного конца капилляра к другому с разной скоростью в зависимости от их заряда, размера и вязкости среды. Чем выше напряжённость электрического поля, тем больше подвижность. Масс-спектрометрия — это аналитический метод, позволяющий идентифицировать химические соединения на основании отношения их массы к заряду (m/z). В ионном источнике молекулы, поступающие из разделительного капилляра, преобразуются в ионы, которые разделяются в зависимости от m/z под воздействием электрического и магнитных полей. Затем разделённые ионы фиксируются детектором. Основная проблема соединения КЭ с МС — выбор оптимального метода ионизации и его сочетание с техникой капиллярного электрофореза. Разделение и обнаружение веществ можно улучшить с помощью подходящего интерфейса. КЭ успешно сочетается с такими методами ионизации, как ББА, ЭРИ, МАЛДИ, ХИАД и ДЭРИ. Наиболее распространённый метод ионизации, хорошо сочетающийся с капиллярным электрофорезом, — электроспрей (ЭРИ).

В первоначальном интерфейсе КЭ-МС использовали капиллярную оболочку из нержавеющей стали, обернутую вокруг конца разделительного капилляра.^[13] Капилляр из нержавеющей стали обеспечивает электрический контакт с фоновым электролитом, вытекающим из разделительного капилляра, тем самым замыкая цепь и инициируя электрораспыление. У данного интерфейса есть несколько недостатков, например, несоответствие скоростей потока двух систем. С тех пор интерфейсные системы постоянно совершенствуют, стараясь обеспечить хороший электрический контакт между разделительным капилляром и масс-спектрометром и постоянную скорость потока. Ещё одним ключевым фактором успешного сочетания КЭ-МС является выбор буферного раствора, который должен быть оптимальным для разделения, но в то же время быть совместимым с электрораспылительной ионизацией. В настоящее время существует три основных типа интерфейсной системы для КЭ-МС, которые кратко обсуждаются ниже. В двух из них используется проводящая обволакивающая жидкость (sheath liquid) для обеспечения электрического контакта.

В этом типе интерфейса электрический контакт между электродом и фоновым электролитом осуществляется с помощью проводящей обволакивающей жидкости (ОЖ). ОЖ протекает во внешней трубке, коаксиально разделительному капилляру, и, смешиваясь с фоновым электролитом на конце капилляра, образует конус Тейлора. В наиболее популярных коммерческих интерфейсах КЭ-ЭРИ-МС используется дополнительная внешняя трубка (трёхтрубная коаксиальная конструкция) с потоком распыляющего газа (sheath gas), который помогает стабилизировать электроспрей и ускорить испарение растворителя. Но было обнаружено, что распыляющий газ может вызывать эффект всасывания около конца капилляра, что приводит к параболическому профилю потока и, как следствие, низкой эффективности разделения.^[3] ОЖ обычно представляет собой смесь воды и метанола (или изопропанол) в соотношении 1:1 с 0,1 % уксусной или муравьиной кислотой. Данный интерфейс отличается стабильностью. Кроме того, выбор фонового электролита гораздо шире, чем в интерфейсе без ОЖ. Однако, поскольку скорость потока ОЖ, необходимая для стабильного электроспрея, обычно довольно большая (1-10 мкл / мин), чувствительность снижается из-за разбавления образцов. ОЖ можно подавать в систему гидродинамическим (с помощью шприцевого насоса) или электрокинетическим способом. Электрокинетический метод позволяет легко работать в режиме наноэлектрораспыления (скорость потока ЭРИ на уровне нл / мин) и, таким образом, повысить чувствительность.^[14]

В настоящее время существует несколько новых подходов и улучшений для интерфейса с использованием ОЖ. Для уменьшения мертвого объема и повышения чувствительности был создан так называемый «расширяемый» интерфейс КЭ-ЭРИ-МС. Кончик разделительного капилляра обрабатывали плавиковой кислотой для уменьшения толщины стенки. Конец разделительного капилляра при этом немного выступает из сужающегося внешнего капилляра. Из-за тонкой стенки разделительного капилляра мертвый объем довольно мал, в результате чего повышается чувствительность и эффективность разделения.^[15] Работа в режиме наноэлектрораспыления (с использованием эмиттеров малого диаметра и скоростями потока ЭРИ ниже 1000 нл / мин) также помогает повысить чувствительность, воспроизводимость и надежность. Для создания такого интерфейса можно использовать, например, боросиликатный эмиттер с заострённым концом и разделительный капилляр с протравленным концом.^[16] Для повышения стабильности и срока службы интерфейса был использован эмиттер с золотым покрытием.^[17]

В этом случае капилляр подсоединяется непосредственно к источнику ЭРИ. Электрический контакт фонового электролита и напряжения источника ЭРИ реализуется путем покрытия конца капилляра проводящим материалом.^[18] Поскольку в этом случае не используется обволакивающая жидкость, разбавляющая пробу, система обладает высокой чувствительностью, низкими скоростями потока и минимальным фоновым сигналом. Однако, такие системы имеют множество недостатков, включая низкую механическую прочность и плохую воспроизводимость.

В одной из последних разработок конструкции интерфейса без обволакивающей жидкости используется пористый эмиттер ЭРИ, обычно получаемый методом химического травления. Данный интерфейс обеспечивает надёжное взаимодействие КЭ с ЭРИ и решает проблемы воспроизводимости и стабильности. С помощью пористого эмиттера ЭРИ удалось соединить системы переходного изотахофореза и капиллярного зонного электрофореза с масс-спектрометрией, что позволило значительно повысить ёмкость КЭ и с высокой чувствительностью определять аналиты, присутствующие в следовых количествах.^[19] Высокая воспроизводимость, надежность и чувствительность может быть также достигнута в системе переходного капиллярного изотахофореза (CITP) или капиллярного зонного электрофореза в сочетании с ЭРИ с использованием проводящей жидкости. Проводящая жидкость контактирует с покрытой металлом внешней поверхностью эмиттера, замыкая контур. В то же время она не смешивается с фоновым электролитом, выходящим из разделительного капилляра, и, следовательно, не происходит разбавления образца.^[20]

В этом методе обычно используют тройник из нержавеющей стали для смешивания фонового электролита, выходящего из разделительного капилляра, с проводящей жидкостью (make up liquid). Разделительный капилляр и эмиттер ЭРИ вставляют в противоположные стороны тройника, при этом между ними поддерживается небольшой зазор фиксированного размера. Проводящая жидкость, находящаяся в зазоре между капилляром и эмиттером, обеспечивает электрический контакт. Эта система довольно простая, недорогая и стабильная. Однако чувствительность снижается из-за разбавления образцов проводящей жидкостью. Одним из видов данного интерфейса является жидкостное соединение, находящееся под давлением (pressurized liquid junction interface). Давление при этом прикладывают к резервуару с проводящей жидкостью. В этом методе разбавление меньше, чем в обычном интерфейсе с жидкостным соединением из-за низких скоростей потока (менее 200 нл / мин). Кроме того, дополнительное давление предотвращает расфокусировку вытекающего потока из капилляра и, как следствие, разрешение возрастает.^[21]

КЭ можно также сочетать с таким методом ионизации, как бомбардировка быстрыми атомами, с использованием интерфейса непрерывного потока.^[22] Интерфейс должен способствовать выравниванию скорости потока между двумя системами. Для ББА необходима довольно высокая скорость потока, в то время как для КЭ для лучшего разделения скорость потока должна быть небольшой. Дополнительный выравнивающий поток можно сделать с помощью обволакивающей жидкости или жидкостного соединения.

При сочетании КЭ и МАЛДИ-МС офлайн, поток, выходящий из разделительного капилляра, распыляют или добавляют по каплям на пластинку МАЛДИ, затем высушивают и анализируют. Для онлайн соединения необходима подвижная пластинка, контактирующая с выходным концом разделительного капилляра. Движущаяся пластинка переносит образцы в масс-спектрометр, где они под воздействием лазера десорбируются и ионизируются. Musyimi с коллегами разработал новую технику, в которой для переноса аналитов из разделяющего капилляра в масс-спектрометр используется вращающийся шар.^[23] Образец на выходе из капилляра смешивается с матрицей, которая подаётся через другой капилляр. По мере вращения шара образец высыхает, прежде чем достигнет области ионизации. Эта техника обладает высокой чувствительностью, поскольку не используются дополнительные потоки, разбавляющие пробу.

Метод КЭ-МС применяется в биоаналитических, фармацевтических, экологических и судебно-медицинских целях.^[24][25] Основное применение КЭ-МС — биологические исследования, особенно анализ белков и пептидов. Кроме того, его часто используют для рутинного анализа фармацевтических препаратов и в клиническом анализе. Исследуя такие биологические жидкости, как кровь и моча, с помощью КЭ-МС можно выявить биомаркеры почечных заболеваний и рака.^[26]

КЭ-МС также можно применять для метаболомики, особенно для профайлинга метаболитов единичных клеток благодаря небольшому объему образца, требуемого для анализа. С помощью КЭ-МС уже были проанализированы нейроны,^[27] эмбрионы лягушки^[28] и клетки HeLa RBC007.^[29] Исследование клеток обычно включает экстракцию молекул небольшим количеством (несколько мкл) органического растворителя перед анализом КЭ-МС. Благодаря новой методике взятия проб с поверхности ткани методом КЭ-МС (англ. surface sampling CE-MS, SS-CE-MS) можно анализировать целые срезы ткани без дополнительной пробоподготовки.^[30]

• Метод жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии
• Масс-спектрометрия
• Капиллярный электрофорез