புரதக் கூழ்ம மின்புல புரைநகர்ச்சி

புரத கூழ்ம மின்புலத் தூள்நகர்ச்சி (protein gel electrophoresis) நுட்பம் புரதங்களை காணும் முறையாகும்.

கட்டமைப்பு

SDS-PAGE இன் படம். புரத அளவிகளை இடது பக்கத்தில் காணலாம்.

டி.என்.எ மற்றும் ஆர்.என்.எ கள் தனது அமைப்பில் பாசுபட் (Phosphate) கொண்டுள்ளதால் அவைகள் எதிர்மின்மம் கொண்டுள்ளன. இதனால் இவைகளை டி.என்.எ அல்லது ஆர்.என்.எ கூழ்ம மின்புலத் தூள்நகர்ச்சி என்னும் முறை கொண்டு காணமுடிகிறது. புரதங்களோ பல அமினோ அமிலங்கள் சேர்க்கப்பட்டு, புரத பிணைப்புகளால் (peptide bond) ஆக்கப்பட்ட ஒரு அமைப்பாகும். மேலும் அமினோ அமிலங்களில் குளுடமேட், அசுபார்ட் (Glutamate, Aspartate) போன்ற அமினோ அமிலங்கள் எதிர்மின்மத்தையும், அர்சினைன், லைசின் (Arginine, Lysine) போன்றவை நேர்மின்மத்தையும் கொண்டுள்ளன. சில வேளைகளில் இசுடிடின் (Histidine) அணுவில் ஏற்படும் மாற்றங்கள் நேர்மின்மத்தை தருகின்றன. மற்ற அமினோ அமிலங்கள் எவ்வித மின்மம் இல்லாமல் நடுவத்தில் உள்ளன. ஒரு புரதத்தின் மின்மம், அவற்றின் அமையும் அமினோ அமிலங்களை பொருந்து அமைகின்றன. எடுத்துக்காட்டக இசுடோன் (Histone) என்கிற புரதத்தை காண்போம். இவைகளில் அர்சினைன், லைசின் போன்ற நேர்மின்மம் கொண்ட அமினோ அமிலங்கள் மிகையாக உள்ளதால் இவைகள் நேர்மின்மத்தை கொண்டுள்ளது. மேலும் இப்புரதங்கள் எதிர்மின்மம் கொண்டுள்ள நிறப்புரியில் (chromosomes) ஒழுங்கான அமைவில் பின்னிபிணைந்து நிறமியன் (Chromatin) ஏற்படுத்துகின்றன. நிறமியனில் மரபணு பகுதிகள், மரபணுயற்ற மற்றும் செய்மதி வரிசைகள் (gene coding, non-coding sequence and satellite sequences) என ஒரு நீண்ட மெல்லிய இழை அல்லது நூலான அமைப்பு ஆகும். அனைந்து நிறப்புரியில் உள்ள டி.என்.ஏ க்களின், ஒரு மெல்லிய நூலாக பார்த்தோம் என்றால், அவைகள் மிக நீண்ட தொலைவில் செல்லும் தன்மை உடையது. ஒரு மர கம்பத்தில் சுற்றி இறுக்கப்பட்ட நூல் கண்டை போல், டி.என்.ஏ க்களை ஒரு சிறு உயிரணுக்களில் , அதுவும் உயிரணுவின் கருவில் சுற்றி இருக்கப்பட்ட அமைப்பாக மற்றும் தன்மை இசுடோனுக்கு உள்ளது. இவ்வளவு நீளம் உள்ள டி.என்.எ க்களை ஒரு உயிரணுவில் உள்ளடங்கி வைப்பவை இசுடோன் புரதம் ஆகும். மேலும் ஒரு நிறப்புரி செயலாக்க நிறமியன்யாகவும் (Euchromatin) வும், செயலற்ற நிறமியன்யாகவும் (Hetetochromatin) மாற்றும் திறன் இசுடோன் புரதத்திற்கு உள்ளது. இப்படியாக பல அற்புதங்களை கொண்ட புரதங்களை காணும் நுட்பமே புரத கூழ்ம மின்துள தூள்நகர்ச்சி நுட்பம் ஆகும்.

கவனத்தில் கொள்ள வேண்டிய கருத்துகள்

டி.என்.ஏ. கூழ்ம மின்புல புரைநகர்ச்சி சியில் காணப்படும் அனைத்து கருத்துகளும் இதில் அடங்கும். இந் நுட்பத்தில் பாலியக்லமிட் மற்றும் பிசு அக்லமிடு (Polyaclamide and Bis-Aclamide) போன்ற பொருட்கள் கூழ்மம் உருவாக்க பயன்படுகிறது. பாலியக்லமிடு ஏற்படும் நேர் பிணைப்புகளும், பிசு அக்லமிடு ஏற்படுத்தும் குறுக்க பிணைப்புகளோடு நுண்ணிய துளைகளை ஏற்படுத்துகின்றன. இவையரண்டும் நரம்பியல் தொடர்பான பாதிப்புகளை ஏற்படுத்த வல்லன. இவைகளுக்கு ஊக்கியாக சோடியம் பை- சல்பேட் (sodium bi sulpahte) பயன்படுகிறது. மேலும் அமில காரதன்மையெய் நிலைநிறுத்த ட்ரிசு (Tris) பயன்படுத்தபடுகிறது. புரதத்திற்கு என்று மின்மம் ஏற்படுத்த இடப்படும் சோடியம் டோடோசில் சல்பைட் (SDS, sodium dodecyll sulphate) என்னும் வேதிப்பொருள் புரதங்களோடு வினைபுரிந்து எதிர்மின்மம் கொடுக்க வல்லன. அதனால் மின்னோட்டத்தின் பொழுது, நேர்மின்மம் நோக்கி புரதங்கள் நகரும்.

காணும் முறைகள்

நகரும் இடைமம் 10X Running buffer

Tris base 30.3 g

Glycine 144 g

SDS 10 g

make to 1L with dH2O

இவ் இடைமத்தை கொண்டு புரதங்கள் கூழ்மத்தில் நகர்த்தப்படுகிறது. இவற்றில் SDS புரதங்களோடு பிணைந்து அவற்றிக்கு எதிர் மின்மம் கொடுப்பதால், நகர்தலின் போது புரதங்கள் நேர் மின்மம் நோக்கி பெயர்வு இருக்கும். இவ் இடைமத்தில் உள்ள TRis Base pH யேய் பராமரிக்க பயன்படுகிறது. இடைமத்தில் கிளைசின் இடப்படுவதால், புரத நகர்த்தல் விரைவாக்கப்படுகிறது.

எசு.டி. எசு. பேச் (SDS-PAGE, Sodium Dodecyl Sulphate- Polyaclamide Gel Electrophoresis)

மேலே குறிப்பிட்டதை போல , சோடியம் டோடோசில் சல்பைட் புரதங்களோடு வினைபுரிந்து எதிர்மின்மத்தையும், அதனால் புரதங்கள் நேர்மின்மத்தை நோக்கி நகரும். மேலும் ஒரே கூழ்மத்தில் இருவகையான கூழ்மம் வெவ்வேறு அடர்வுகளோடும், அமில காரத்தன்மையோடு இருக்கும்.

௧. மேல் கூழ்மம் (Stacking gel)

இவைகள் 4% அடர்வோடு, பெரிய நுண் துளைகளோடு இருப்பதால், புரதங்கள் விரைவாக நகரும்.

௨. கீழ் கூழ்மம் (Resolving gel)

இவைகள் 12-14% அடர்வோடு நுண் துளைகளை கொண்டுள்ளதால், புரதங்கள் மெதுவாக நகர்ந்து நன்றாக பிரிக்கப்படும்.

மெய் கூழ்மம் (native gel) :

இம்முறையில் எஸ்.டி.எஸ். பயன்படுந்தபடுவதில்லை. நேர்மின்மம் கொண்ட புரதங்கள் எதிர்மின்மத்தையும், எதிர்மின்மம் கொண்ட புரதங்கள் நேர்மின்மத்தை நோக்கி நகரும். மின்மம் அற்ற புரதங்கள் ஒரு புள்ளியில் நிலை நிறுத்தப்படும் . இந்நிகழ்வுக்கு ஒத்தமின் ஒருங்கவைவு புள்ளி (Isoelctric focusing point) எனப்படும்.