புரதங்களுக்கு இடையேயான இணைவாக்கம்

புரதங்களுக்கு இடையேயான இணைவாக்கம் (protein-protein interaction) என்கிற நுட்பத்தைப் பயன்படுத்தி இரு மூலக்கூறுகளுக்கு இடையே அல்லது ஒரு மூலக்கூறுக்குள் நடைபெறும் இணைவுகளை (இடையியக்கங்களை)க் கண்டறியலாம். மூலக்கூறு உயிரியலில் இந்நுட்பம் மிகுதியாக நடைமுறைபடுத்த படுகிறது. மூலக்கூறு உயிரியலின் ஒவ்வொரு நிகழ்வும் (டி.என்.ஏ ஆனது ஆர்.என்.எ வாக மாறுதல், புரத உருவாக்கம், வளர்சிதை மாற்றங்கள், உயிரணு குறிகை தருதல் (cell signaling) மூலக்கூறுகளுக்கு இடையே நடைபெறும் இணைவுகளால் ஆக்கம் பெறுகிறது. ஒரு புரதம் மற்றொரு புரதத்தோடு பிணைந்து ஒரு வினையை ஊக்குவிக்கும் அல்லது மட்டுப்படுத்தும் நிகழ்வுக்கு ஊக்கம் /மட்டுப்படுத்துதல் (on/off) (தொடக்கு/நிறுத்து) செயல் என மூலக்கூறு உயிரியலில் அழைக்கப்படுகிறது.

தீ நுண்மங்கள் அல்லது பாக்டிரியா உயிரினத்தில் உள்- ஊடுருவியபின், உயிரினத்தின் புரதத்தோடு இணைந்து பல ஆக்கங்களைச் செயல்படுத்தும். இச்செயல்கள் அவற்றின் நிகழிடமாய் இருக்கும் உயிரினம் (Host) விரும்பியோ அல்லது விரும்பாமலோ அயல் பொருள்களின் கட்டாயத்தின் பெயரில் நடைபெற்று , நுண்ணுயிர்களை பல்கிப் பெருக்க கரணியமாக அமைகிறது. இதனால் நுண்ணுயிர்கள் நோயின் வீரியத்தை கூட்டுகின்றன.

தீநுண்மத்தின் சில மரபணு, மரபணு ஓடுத்தலின் ஒடுக்கிகிளாக செயல்படுவது போல், தீநுண்மத்தின் சில மரபணுக்கள் உயிர்னத்தின் புரதங்களோடு இணைந்து தனக்கு தேவையான மரபணு வழிகளை ஊக்கம்/ மட்டுப்படுத்தல் வினைக்கு உட்படுத்தும். இதனால் தீமை விளைவிக்கும் நுண்ணுயிர்கள் எவ்வகையான புரதங்களோடு இணைகின்றன என்பதை அறியவும், மூலக்கூறு உயிரியலின் ஒவ்வொரு நிகழ்வும் எப் புரதத்தோடு இணைந்து ஆக்கம் பெறுகின்றன என்பதைப் புரிந்து கொள்ளவும், ஆய்வாளர்கள் புரதங்களுக்கு இடையேயான இணைவாக்கம் (protein-protein interaction) என்ற நுட்பத்தை பயன்படுத்துகின்றனர்.

நான்கு முறைகள்

புரதங்களுக்கு இடையேயான இணைவாக்கத்தை அறிய பல முறைகள் இருந்தாலும், பின்வரும் நான்கு முறைகள் பரவலாக நடைமுறையில் உள்ளன.

௧. ஒத்ததிர்வு ஒளிர்வின் (மினுப்பின்) ஆற்றல் கடத்தல் முறை (Fluorescence Resonance Energy Transfer)

௨. ஒளிரின் (மினுப்பின்) மருயிணைவு முறை (Bi-molecular florescent complementation assay)

௩. ஈசிட்டு இரு-கலப்பின முறை (yeast two-hybrid system)

௪. உள்- இழுத்தல் முறை ( pull-down assay)

இந்நான்கு முறைகளுக்கும் பக்டிரியல் படிவாக்கம் (bacterial cloning) என்ற நுட்பமும் மிக முக்கியமானது. முதல் இருமுறைகளில் மூலக்கூறு இணைவதை அறிவதோடு, புரதங்களின் இருப்பிடத்தையும் அறிய முடியும் என்பது தனிச்சிறப்பு.

முதல் மூன்று முறைகளுக்கும் இருவாழ் வெக்டர் (binary vector) என்ற பிளாசுமிட் பயன்படுத்த படும். மேலும் இவ்மூன்று முறைகளும் நேரடியாக வாழும் உயரணுவில் (living cells) ஆய்வுகள் செய்யப்படுவது ஒரு தனிப்பட்ட சிறப்பாகும்.

நான்காவது முறையான உள்- இழுத்தல் முறைக்கு புரத உற்பத்தியை செயற்கையாக மிகைபடுத்த ஒரு பிளாசுமிட் (expression vectors) பயன்படுத்த படும். மேலும் மூலக்கூறுகள் இணைந்து உள்ளனவா என அறிய வெசுட்டர்ன் பிளாட் (western blot) என்ற ஒரு முறையைக் கூடுதலகாக செய்ய வேண்டி இருக்கும்.

ஒத்ததிர்வு ஒளிர்வின் (மினுப்பின்) ஆற்றல் கடத்தல் முறை

காணும் முறைகள்:

இரு மூலக்கூறுகள் இணையும் போது (GFP, CFP) , மூலக்கூறு இடையே ஆற்றல் கடத்தப்படும் முறைய விளக்கும் படம்

௧. படியெடுப்பு

௨. உள்செலுத்துதல் முறை (transfection in animal, infiltration in plant)

௩. ஒருதள நுண்ணோக்கி (கான்ஃபோக்கல் நுண்ணோக்கி) (confocal microscope)

இம்முறை அறிவதற்கு உயிர்-இயற்பியல் சிறிது அறிந்து இருக்க வேண்டும். இரு மூலக்கூறுகள் இணையும் போது , மூலக்கூறு இடையே ஆற்றல் கடத்தப்படும். இந்த தத்துவமே இம்முறையில் அமுல்படுத்த படுகிறது.

இணைவுகள் இருக்கிறதா? இல்லையா என ஆய்வுக்கு எடுத்து கொள்ளப்படும் இரு புரதத்தின் மரபணுப் பகுதிகள் இரு வெவ்வேறு வெக்டாரில் ஒரு ஒ(மி)ளிரும் புரதத்தோடு பிணைத்து (fusion) வடிவாக்கம் செய்யப்படுகின்றன ( எ.கா. பச்சை அல்லது மஞ்சள் மிளிரும் புரதம் மற்றும் நீல மிளிரும் புரதம். இவை நேரடியாக கலத்தில் உள்செலுத்துதல் (transfection in animal, infiltration in plant) என்னும் முறையில் உள்-தள்ளப்படுகின்றன. பின் நுண்நோக்கியில் புரத இணைவுகளை காணலாம்.

ஒளிர்வின் (மினுப்பின்) மருயிணைவு முறை (Bi-molecular florescent complementation assay)

௧. படியெடுப்பு

௨. உள்செலுத்துதல் முறை (transfection in animal, infiltration in plant)

௩. ஒருதள நுண்ணோக்கி (கான்ஃபோக்கல் நுண்ணோக்கி) (confocal microscope)

இம்முறையில் ஒரே மிளிரும் ( எ.கா. நீல மிளிரும் புரதம்) புரதத்தின் இரு முனைகள் (N and C-terminal end) இரு வெவ்வேறு வெக்டரில் வடிவாக்கம் செய்யப்பட்டு இருக்கும். நாம் விரும்பும் மூலக்கூறின் மரபணு பகுதியெய் இம்முனைகளோடு பிணைந்து வடிவாக்கம் செய்ய வேண்டும்.

இவ்விரு மூலக்கூறுகள் இணையும் பொழுது, பிரிந்த ஒளிரும் புரதத்தின் இரு முனைகள் இணைக்கப்பட்டு மிளிரும் தன்மையெய் அடையும். மிளிரும் தன்மை இல்லையெனில் இரு மூலக்கூறு இடையில் இணைவாக்கம் இல்லை என பொருள்.

'

ஈசுட்-இரு கலப்பின முறை:

கொதிய இரு கலப்பின முறையெய் விளக்கும் படம்.

தேவையான முறைகள்:

௧. படிவாக்கம் அல்லது வடிவாக்கம்

௨. அமினோ அமிலங்கள்

இம்முறையும் ஒளிரின் (மினுப்பின்) மருயிணைவு முறை போன்றது என்றாலும், ஒரு வெக்டார் (பரப்பி) செயலூக்கியின் முனை (Activation domain) எனவும், மற்றுமொரு வெக்டார் (பரப்பி) பிணைவு முனை (Binding domain) என அழைக்கப்படும். இவ்விரு பரப்பிகளில், இணைவாக்கம் காண விரும்பும் புரத்தின் மரபணு பகுதி படிவாக்கம் செய்யப்படும். இரு மூலக்கூறு இடையெய் இணைவாக்கம் நடைபெற்றால், ஈசுட் சில குறிபிட்ட அமினோ அமிலம் இல்லாத வளர் உணவில் (media) வளரும். மேலும் வளரும் ஈசுட், நீல நிற முடையதாக இருக்கும். நீல நிறத்திற்கு lacZ மற்றும் X-Gal என்ற மரபணுவும், வேதிபொருளும் வளர் உணவில் கூடுதலாக இட வேண்டும்.

உள்- இழுத்தல் முறை ( pull-down assay)

தேவையான முறைகள்:

௧. பக்டிரியல் படிவாக்கம் அல்லது வடிவாக்கம்

௨. புரத மிகைப்படுத்துதல் (Protein expression)

௩. கூம்பு குழாய் பிரித்தல் (column separator)

இம்முறையில் இணைவாக்கம் காண விரும்பும் புரதங்களை புரத மிகைப்படுத்துதல் முறைக்கு உட்படுத்தப்படும். ஒரு புரதத்தை கூம்பு குழாயில் வைக்கப்பட்டு ஒரு வடிகட்டியாக மாற்றப்படும். இக்குழாயின் வழியாக புரத கலவையெய் (crude protein) கடத்தும் போது, இணையும் புரதம் வடிகட்டியாக செயல்படும் மூலக்கூருவோடு பிணைந்து குழாயில் தங்கிவிடும். இணையாத மற்ற புரதம் எல்லாம் வழித்தோடும் நீருடன் வெளியேற்றப்படும், அதனால்தான் இம்முறைக்கு உள்-இழுக்கும் முறை.

இந்நான்கு முறைகளிலும், ஆய்வாளர்களின் பார்வையில் முதல் இரு முறையும், மற்றும் நான்காவது முறையும் நம்பதகுந்தாகும். ஈசுட்-இரு கலப்பின முறையில் கசியும் வெளிப்பாடு (leaky expression) இருப்பதால் தவறுகள் நடைபெற வாய்ப்புகள் மிகுந்ததாக உள்ளன.