Транспортно-матрична РНК

Транспортно-матрична РНК (скорочено тмРНК, також відома як 10Sa РНК і за генетичною назвою SsrA ) — це бактеріальна молекула РНК із подвійними властивостями, подібними до транспортних та інформаційних РНК. тмРНК утворює рибонуклеопротеїновий комплекс разом із білком SmpB, фактором елонгації Tu ( EF-Tu ) і рибосомальним білком S1. тмРНК виконує ключову роль у прокаріотичному процесі транс-трансляції, необхідному для забезпечення точності трансляції білка. Коли рибосома затримуються у процесі біосинтезу білка, наприклад у випадку досягнення кінця матричної РНК, яка не містить стоп-кодону. ТмРНК виконує одразу декілька функцій: вона звільняє рибосому, що зупинилася, додає до дефектного синтезованого поліпептиду мітку, що індукує його протеоліз, та сприяє деградації аберантної інформаційної РНК . ^[1] У більшості бактерій ці функції виконують стандартні однокомпонентні тмРНК . В інших бактеріальних видах змінений ген ssrA виробляє двокомпонентну тмРНК, у якій два окремі ланцюги РНК з’єднані за допомогою спарювання основ.

Вперше тмРНК була виділена в 1979 шляхом розділення електрофоретичної фракції 10S Escherichia coli на тмРНК (10Sa) і подібну за розміром РНК-складової РНКази Р (10Sb).^[2] Присутність псевдоуридину в змішаній фракції 10S РНК вказувала на те, що тмРНК має модифіковані основи, характерні також для тРНК. При секвенуванні гену ssrA Mycobacterium tuberculosisбула виявлена подібність 3'-кінця тмРНК до TψC-петлі тРНК.^[3] Подальше порівняння послідовностей виявило повний тРНК-подібний домен (TLD), утворений 5'- та 3'- кінцями тмРНК, який має акцепторну ділянку подібну до такої у аланінової тРНК, що робить можливим її аміноацилювання аланін-тРНК-синтетазою.^[4] На відміну віж тРНК тмРНК не має антикодонової ділянки, а D-ділянка містить лише D-петлю без D-стебла.

Характерною особливістю усіх тмРНК є консервативний тРНК-подібний домен (TLD), що складається з спіральних ділянок 1, 12 і 2a (аналогів акцепторного, Т- і варіабельного стебел тРНК відповідно) і містить 5' монофосфатний і аланільований 3' CCA-кінець. мРНК-подібна ділянка (MLR) у стандартній тмРНК є великою петлею, що містить псевдовузли і кодуючу послідовність (CDS) для пептидної мітки довжиною 10-27 амінокислот, обмежену кодоном відновлення і стоп-кодоном. Кодований пептид мітки варіює між бактеріями, можливо, залежно від набору наявних протеаз та адаптерів.^[5]

тмРНК зазвичай містять чотири псевдовузли, один з яких (pk1) знаходиться вище ділянки CDS, а інші три псевдовузли (pk2 - pk4) - нижче за CDS. Попри загальну косервативність тмРНК, псевдовузли є достатньо еволюційно пластичними. Наприклад, у однокомпонентних тмРНК ціанобактерій pk4 заміщений двома тандемно розташованими меншими псевдовузлами. Це свідчить про те, що вторинна структура тмРНК за межами TLD є важливою, проте псевдовузли є одними з перших структур, які втрачаються при розбіжності послідовностей ssrA в лініях пластид та інших ендосимбіонтів.^[6][7]

Кругова пермутація^[en] ssrA була виявлена в трьох основних лініях:

1. у всіх альфа-протеобактерій і примітивних мітохондріях протистів Jakobida;
2. у двох розрізнених групах ціанобактерій (Gloeobacter і клада, що містить Prochlorococcus і багато представників Synechococcus);
3. у деяких представників бета-протеобактерій (Cupriavidus і деяких Rhodocyclales).^[8][9]

Всі вони утворюють подібні двокомпонентні мтРНК, що складаються з акцепторної та кодуючої частин. Така мтРНК еквівалентна стандартній формі, але розрізана після кодувальної послідовності CDS. У таких мтРНК зберігається не більше 2 псевдовузлів, порівняно з 4 чи більше в стандартних мтРНК.

Альфапротеобактерії мають дві характерні послідовності: заміну типової послідовності ТΨC-петлі TΨCRANY на GGCRGUA та послідовність AACAGAA у великій петлі 3´-кінцевого псевдовузла. У мітохондріях MLR була втрачена. Значна репермутація мітохондріальної ssrA призводить до утворення невеликого однокомпонентного продукту у Jakoba libera.^[10]

Ціанобактерії є найбільш вірогідним прикладом утворення пермутованого гена зі стандартного, через значну схожість послідовностей обох типів генів, які зустрічаються в різних штамах.

Більшість тмРНК транскрибуються у вигляді більших попередників, які піддаються процесингу подібно до тРНК. Розщеплення на 5'-кінці відбувається за допомогою рибонуклеази Р.^[11] 3'-кінець найчастіше піддається процесингу за допомогою РНКаз Т та PH.^[12][13] Залежно від виду бактерій, 3'-CCA або кодується, або додається за допомогою тРНК-нуклеотидилтрансферази.

Подібний процесинг у внутрішніх сайтах попередниці тмРНК пояснює її фізичне розщеплення на дві частини. Двокомпонентні тмРНК мають два додаткові кінці, процесинг яких необхідно враховувати. Для альфапротеобактерій один 5'-кінець є необробленим сайтом початку транскрипції. ^[14] Дальній 3'-кінець може в деяких випадках бути результатом rho-незалежної термінації транскрипції.

Структурні моделі з високою роздільною здатністю повних молекул тмРНК наразі недоступні, і їх може бути важко отримати через притаманну MLR гнучкість. У 2007 році була отримана кристалічна структура тмРНК Thermus thermophilus, зв'язаної з білком SmpB, з роздільною здатністю 3 Å. Ця структура показує, що SmpB імітує D-стебло та антикодон канонічної тРНК, тоді як спіральна ділянка 2a тмРНК відповідає варіабельному плечу тРНК.^[17] Кріоелектронне мікроскопічне дослідження тмРНК на ранній стадії транс-трансляції показує просторові взаємовідносини між рибосомою і тмРНК (тмРНК, зв'язаною з білком EF-Tu). TLD розташований поблизу ГТФазо-асоційованого центру в 50S субодиниці рибосоми; спіральна область 5 і псевдовузли pk2 - pk4 утворюють дугу навколо 30S субодиниці рибосоми.^[18]

Кодування тмРНК було відкрито в 1995 році, коли Сімпсон з колегами оверекспресували рекомбінантний мишачий цитокін IL-6 в E. coli і виявили кілька усічених пептидів, похідних від цитокінів, кожен з яких на С-кінцях мав однаковий 11-амінокислотного залишку (A)ANDENYALAA.^[19] За винятком N-кінцевого аланіну, який походить з 3' кінця самої тмРНК, ця послідовність походить від короткої відкритої рамки зчитування тмРНК E. coli. Кейлер та ін. з'ясували, що така пептидна мітка забезпечує протеоліз, і запропонували модель транс-трансляції, опосередкованої тмРНК.^[20]

Хоча деталі механізму транс-трансляції ще досліджуються, загальновизнано, що тмРНК спочатку зв'язується з ділянкою А рибосоми, що зупинилася у процесі трансляції. Згодом рибосома переміщується з 3' кінця пошкодженої мРНК на кодон відновлення MLR, після чого трансляція продовжується в нормальному режимі на матриці кодуючої послідовності тмРНК, поки не доходить до стоп-кодону. Деяким видам бактерій транс-трансляція життєво необхідна, тоді як інші використовують її лише у стресових умовах.^[21] Вважається, що тмРНК може відігравати роль у антибіотикорезистентності, рятуючи рибосоми, зупинені антибіотиками, що впливають на трансляцію.^[22] Залежно від організму, пептидні мітки можуть розпізнаватися різноманітними протеазами або протеазними адаптерами.^[23]

ssrA може як бути мішенню для одних мобільних генетичних елементів, так і переноситись за допомогою інших МГЕ. Було виявлено встроювання трьох типів МГЕ у цей ген. Жоден з них не порушує функцію гена: інтрони групи I видаляються шляхом самосплайсингу, рикетсійні паліндромні елементи (RPE) вбудовуються в некритичні ділянки, а геномні острівці, що кодують інтегразу, роз'єднують ssrA, але відновлюють одну з відщеплених ділянок.^{[24][25][26][27]}

Нехромосомний ssrA був вперше виявлений в геномному дослідженні мікобактеріофагів (у 10% фагів).^[28] Також були знайдені інші МГЕ, що містять ssrA, наприклад, плазміди та геномні острівці. Одним з цікавих випадків є Rhodobacter sphaeroides ATCC 17025, чий нативний ген тмРНК порушений геномним острівцем. На відміну від усіх інших геномних острівців у генах тмРНК (або тРНК), цей острів інактивував нативний ген-мішень без відновлення відщепленого фрагмента, але компенсував це за рахунок наявності власного гена тмРНК. Дуже незвичайний родич ssrA виявлений у літичного мікобактеріофага DS6A, який кодує трохи більше, ніж TLD.

Мітохондріальна, структурно редукована форма тмРНК (мт-тмРНК) була вперше виявлена у джгутикових найпростіших Reclinomonas americana.^[29] Згодом наявність мітохондріального гена ssrA, що кодує тмРНК, а також сайтів транскрипції та процесингу РНК було підтверджено для всіх представників якобід, окрім одного.^[30][31] Докази функціональності - аміноацилювання мт-тмРНК аланіном - виявлені у Jakoba libera.^[31] Нещодавно ssrA також було ідентифіковано в мітохондріальних геномах ооміцетів.^[32] Як і в α-протеобактерій (предків мітохондрій), mt-тмРНК мають кругову пермутацію, тобто представлені двокомпонентними молекулами, за винятком Jakoba libera, де ген повернувся до кодування однокомпонентної тмРНК.^[31]

Спочатку гени мітохондріальної тмРНК визначались за короткими послідовностями, консервативними серед якобід, що схильні згортатись у тРНК-подібну вторинну структуру. Завдяки наявності дев'яти повних послідовностей мтДНК якобід^[33] та значному вдосконаленню інструментів пошуку коваріацій (Infernal;^[34][35][36]) було розроблено коваріаційну модель на основі мітохондріальних тмРНК якобіда, за допомогою якої ідентифіковано гени мітохондріальної ssrA у ооміцетів. Наразі виявлено 34 мт-тмРНК ооміцетів у шести родах: Albugo, Bremia, Phytophthora, Pseudoperonospora, Pythium та Saprolegnia. Коваріаційна модель, побудована з використанням послідовностей якобід і ооміцетів, тепер доступна на Rfam під назвою "mt-tmRNA".^[37]

Стандартна бактеріальна тмРНК складається з тРНК(Ala)-подібного домену (дозволяє додавати некодований аланін до мРНК, які не мають стоп-коду) та мРНК-подібного домену, що кодує білкову мітку, яка спрямовує поліпептид на протеоліз. мРНК-подібний домен був втрачений у мт-тмРНК. Порівняльний аналіз послідовностей вказує на особливості, характерні для мт-тмРНК.^[38] Найбільш консервативною є первинна послідовність аміноацил-акцепторної основи. Ця частина молекули має незмінний залишок А в позиції дискримінатора і пару G-U в позиції 3 (за винятком Seculamonas ecuadoriensis, яка має пару G-C). Ця позиція є сайтом впізнавання для аланіл-тРНК-синтази.

P2 - це спіраль змінної довжини (від 3 до 10 пар основ), що відповідає антикодоновій ділянці тРНК, але без антикодонової петлі (оскільки вона не потрібна для функціонування тмРНК). P2 стабілізує тРНК-подібну структуру, але чотири нуклеотиди, інваріантні для ооміцетів та якобід, вказують на додаткову, наразі не ідентифіковану функцію. P3 має п'ять пар основ і відповідає ТψC-ділянці тРНК, але з різними консенсусними нуклеотидами як у стеблі, так і в петлі. Послідовність ТψC-петлі консервативна у ооміцетів та якобід, з невеликими відхиленнями (наприклад, у Saprolegnia ferax). Нарешті, замість тРНК-подібної D-ділянки з укороченою тринуклеотидною D-петлею, характерної для бактеріальних тмРНК, мітохондріальні аналоги мають дуже варіабельну петлю довжиною від 5 до 14 п.н.

Дані секвенування РНК Phytophthora sojae показують рівень експресії мт-тмРНК, подібний до рівня експресії сусідніх мітохондріальних тРНК, а чотири основні процесингові сайти підтверджують передбачувані кінцеві ділянки зрілої мт-тмРНК.^[39] Молекула-попередник тмРНК, ймовірно, обробляється РНКазою Р та специфічною ендонуклеазою, що забезпечує процесинг 3' тмРНК. Остання, як припускають, видаляє проміжну послідовность. Після додавання CCA до 3' дискримінаторного нуклеотиду, до тмРНК приєднанується залишок аланіну за допомогою аланіл-тРНК-синтетази.

• CLPP
• Рибосома
• Матрична РНК
• Транспортна РНК