Рестрикционен ензим, рестрикциона ендонуклеаза, илирестриктаза е ензим кој ја сече ДНК молекулата на фрагменти, на или во близина на специфични места кои ги препознава, наречени рестрикциони места.[1][2][3] Рестрикционите ензими спаѓаат во групата на ендонуклеази. Рестрикционите ензими најчесто се класифицираат во пет типови, кои се разликуваат во однос на нивната структура и во однос на тоа дали го сечат ДНК супстратот точно на местото кое го препознаваат или на друго место кое не е исто со местото на препознавање. За да ја пресечат ДНК, сите рестрикциони ензими прават два засеци, секој на една од веригите на двојната завојница.
Овие ензими се среќаваат во бактериите и археите и се дел од одбранбениот механизам на клетката против вируси.[4][5] Во внатрешноста на прокариотската клетка, рестрикционите ензими селективно ја сечат страната ДНК во процес кој се нарекува рестрикциона дигестија; во исто време, ДНК на домаќинот е заштитена со помош на модификациски ензим (метилтрансфераза) кој врши модификација на прокариотската ДНК за да ја заштити од дејството на рестрикционите ензими. Заедно, овие два процеса го формираат рестрикционо-модификациониот систем.[6]
Досега се проучени во детали над 3000 рестрикциони ензими, а повеќе од 600 од нив се достапни комерцијално.[7] Овие ензими рутински се користат за модификација на ДНК во лабораториите, и тие се важна алатка во молекуларното клонирање.[8][9][10]
Место на препознавање
Палиндромското место на препознавање се чита на ист начин и на двете вериги кога се чита во иста насока.
Рестрикционите ензими препознаваат одредена низа на нуклеотиди[2] и создаваат пресек на двете вериги на ДНК. Низите кои ги препознаваат можат да бидат класифицирани врз основа на бројот на базите во низата, кој најчесто изнесува помеѓу 4 и 8. Бројот на базите во низата утврдува колку често тоа место случајно би се појавувало во даден геном, на пример, низа од 4 бази теоретски би се појавувала еднаш на секои 4^4 = 256 базни парови (бп), низа од 6 бази еднаш на секои 4^6 = 4096 бп, а низа од 8 бази еднаш на секои 4^8 = 65.536 бп.[11] Многу од овие низи се палиндроми, што значи дека се читаат на ист начин и во двете насоки (напред и назад).[12] Во ДНК можат да се јават два типа на палиндромски низи. Огледалниот палиндром е сличен на оној кој се среќава во обичниот текст, во кој една низа се чита на ист начин напред и назад, како што е, на пример, GTAATG. Палиндромот на превртено повторување исто така се чита исто напред и назад, но овде низите се наоѓаат на спротивните, комплементарни нишки (односно, кај двоверижна ДНК), како што е, на пример, GTATAC (GTATAC е комплементарна на CATATG).[13] Палиндромите на превртено повторување се почести и имаат поголема биолошка значајност од огледалните палиндроми.
Сечењето кое го врши ензимот EcoRI создава „лепливи краеви“,
додека сечењето кое го врши ензимот SmaI создава „тапи краеви“:
Низите на препознавање на ДНК се разликуваат за секој рестрикционен ензим, па поради тоа има разлики во должината, низата и ориентацијата (5' крај или 3' крај) на протрудирачките лепливи краеви кои ги создава ензимот.[14]
Типови
Рестрикционите ендонуклеази кои се среќаваат во природата се категоризирани во четири групи (тип I, тип II, тип III и тип IV) врз основа на нивниот состав, ензимскиот кофактор кој го користат, природата на нивната целна низа и позицијата на местото на ДНК кое го сечат во однос на целната низа.[15][16][17] Меѓутоа, анализите на ДНК-низите на рестрикционите ензими покажуваат поголеми варијации, што сугерира дека постојат повеќе од четири типа.[18] Сите типови на рестрикциони ензими препознаваат специфични кратки ДНК-низи и вршат ендонуклеолитичко сечење на ДНК чиј производ се специфични фрагменти со терминални 5'-фосфати. Тие се разликуваат по низата која ја препознаваат, составот на подединиците, позицијата за сечење и кофакторот кој го користат:[19][20]
Тип I ензимите (EC 3.1.21.3) сечат место кое е далеку од местото на препознавање; како кофактори користат ATP и S-аденозил-L-метионин; тие се мултифункционални белковини кои делуваат и како рестрикциони ензими и како метилази (EC 2.1.1.72).
Тип II ензимите (EC 3.1.21.4) сечат место кое е во рамките или на одредено кратко растојание од местото на препознавање; повеќето користат магнезиумов јон како кофактор; имаат функција само на рестрикциони ензими.
Тип III ензимите (EC 3.1.21.5) сечат место кое е на кратко растојание од местото на препознавање; користат ATP (но не го хидролизираат); S-аденозил-L-метионинот ја поттикнува реакција, но не е неопходен; постојат како дел од комплекс со модификациона метилаза (EC 2.1.1.72).
Тип IV ензимите целат на изменетата ДНК, на пример, метилирана, хидроксиметилирана и гликозил-хидроксиметилирана ДНК.
Номенклатура
Изведување на името EcoRI
Кратенка
Значење
Опис
E
Escherichia
род
co
coli
вид
R
RY13
сој
I
Прв идентификуван
редот по кој се идентификувани во бактеријата
Од нивното првично откривање во 1970-тите години, многу рестрикциони ензими биле идентификувани; на пример, карактеризирани се повеќе од 3500 различни тип II рестрикциони ензими.[21] Секој ензим е именуван по бактеријата од која бил изолиран, со употреба на систем за именување кој се заснова на бактерискиот род, вид и сој.[22][23]
Употреба
Изолираните рестрикциони ензими се користат за манипулирање со ДНК молекули за различни научни цели.
Тие се користат за да се овозможи вметнување на гени во плазмидните вектори за време на експериментите на клонирање на гени и производството на белковини.[24][25]
Рестрикционите ензими може да се користат и за разликување на генските алели со специфично препознавање на единечни базни промени во ДНК познати како еднонуклеотидни полиморфизми.[26][27] Ова е можно само ако еднонуклеотидниот полиморфизам го промени рестрикционото место присутно во алелата. Со овој метод, рестрикциониот ензим може да се користи за да се генотипизира ДНК без употреба на скапо генско секвенционирање.
На сличен начин, рестрикционите ензими се користат за дигестија на геномската ДНК за анализирање на гени со Southern blot. Оваа техника им овозможува на истражувачите да идентификуваат колку копии (или паралози) на генот се присутни во геномот на една единка, или колку генски мутации (полиморфизми) се присутни во дадена популација.[28]
Вештачките рестрикциони ензими создадени со поврзување на FokI доменот за сечење на ДНК со низа на ДНК врзувачки белковини или низи од цинкови прсти, наречени цинкови прсти нуклеази (ZFN), се моќна алатка за менување на геномот поради нивната голема специфичност за одредени низи.
↑ 2,02,1„Specificity of restriction endonucleases and DNA modification methyltransferases a review (Edition 3)“. Gene. 92 (1–2): 1–248. August 1990. doi:10.1016/0378-1119(90)90486-B. PMID2172084.
↑Pingoud A, Alves J, Geiger R (1993). Burrell M (уред.). Enzymes of Molecular Biology. Chapter 8: Restriction Enzymes. Methods of Molecular Biology. 16. Totowa, NJ: Humana Press. стр. 107–200. ISBN0-89603-234-5.
↑Micklos DA, Bloom MV, Freyer GA (1996). Laboratory DNA science: an introduction to recombinant DNA techniques and methods of genome analysis. Menlo Park, Calif: Benjamin/Cummings Pub. Co. ISBN0-8053-3040-2.
↑Massey A, Kreuzer H (2001). Recombinant DNA and Biotechnology: A Guide for Students. Washington, D.C: ASM Press. ISBN1-55581-176-0.
↑„Letter: A suggested nomenclature for bacterial host modification and restriction systems and their enzymes“. Journal of Molecular Biology. 81 (3): 419–23. December 1973. doi:10.1016/0022-2836(73)90152-6. PMID4588280.
↑Russell DW, Sambrook J (2001). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory. ISBN0-87969-576-5.
↑„Combining allele-specific fluorescent probes and restriction assay in real-time PCR to achieve SNP scoring beyond allele ratios of 1:1000“. BioTechniques. 44 (2): 193–4, 196, 199. February 2008. doi:10.2144/000112719. PMID18330346.
Goodsell DS (2000-08-01). „Restriction Enzymes“. Molecule of the Month. RCSB Protein Data Bank. Архивирано од изворникот на 2008-05-31. Посетено на 2008-06-06.
Palmer M. „WatCut“. University of Waterloo, Ontario, Canada. Архивирано од изворникот на 2007-06-18. Посетено на 2008-06-06. An on-line tool for restriction analysis, silent mutation scanning, SNP-RFLP analysis
„NEBcutter V2.0“. New England Biolabs Inc. Посетено на 2008-06-06. Restriction enzyme finder
